【導讀】液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質，在其表

液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。下面介紹一下反相色譜柱的選擇和使用：

一、反相色譜柱的選擇

1.柱子的PH值使用范圍

反相柱優點是固定相穩定，應用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質的填料，使用時**要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時，會導致鍵合相的水解;當PH值大于7時硅膠易溶解;經常使用緩沖液固定相要降解。一旦發生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。

2.填料的端基封尾（或稱封口）

把填料的殘余硅羥基采用封口技術進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量**了，有利于不易保留化合物的分離;填料穩定性好了，組分的保留時間重現性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，***好選用填料經端基封尾的色譜柱。

二、液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前，***好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是***佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理

a、***好使用流動相溶解樣品。

b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。

c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

2、流動相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有**的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。

b、流動相與樣品不產生化學反應c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。

d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，***好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。

f、在流動相配制好后，**要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。

3、流動相流速的選擇

因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求***佳柱效，***好使用***佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。

當選用***佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

a.含水流動相***好在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。***好加入疊氮化鈉，防止**生長。

b.流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質。

c.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

三.色譜柱的維護

1.色譜柱的平衡

反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請**確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得**的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟：

a.平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡）

b.如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡;分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

2.色譜柱的再生

長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數減低）。可以對色譜柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。

建議用來沖洗柱子的溶劑體積

色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積

125-4mm1.6ml30ml

250-4mm3.2ml60ml

250-10mm20ml400ml

選擇再生方法：

極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：

正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

非極性固定相（如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等）的再生：水→乙腈→（或異丙醇）→乙腈→水

注意：

a.在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液**流出稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠**洗去硅膠表面吸附的雜質，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3.色譜柱的維護

a.使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有**的溶解度）

b.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍

c.避免流動相組成及極性的劇烈變化

d.流動相使用前必須經脫氣和過濾處理

e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

f.氯化物的溶劑對其有**的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕

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　　【***** 使用手冊】氣相色譜操作條件的選擇，常常決定是否能夠達到分離的目的，而選擇試驗條件的主要依據是范氏方程和分離度與各種色譜參數的關系式。氣相色譜柱分析條件的選擇主要包括柱溫、載氣種類和流速等的選擇。適當的分析條件，可以在較短的時間內完成分析工作，并達到良好的定性定量目的。在日常工作中，如何進行色譜柱分析條件的選擇呢？　　柱溫的選擇　　柱溫是影響分析時間和分離度的重要因素。選擇柱溫的依據是樣品的沸點范圍，固定液的配比，允許使用溫度，以及檢測器的靈敏度。　　柱溫主要影響分配系數、容量因子以及組分在流動相和固定相中的擴散系數，從而影響分離度和分析時間。選擇溫柱的原則，一般是在使難分離物質對達到要求的分離度條件下，盡可能采用低溫柱，其優點是可以增加固定相的選擇性，降低組分在流動相中的縱向擴散，提高柱效，減少固定液的流失、延長柱壽命和降低檢測器的本底。　　提高柱溫可以使保留時間減少，加快分析速度，使樣品中組分**流出，但是分離效果不好。降低柱溫，樣品有較大的分配系數，選擇性高，有利于分離。但溫度過低，容易引起峰形拖尾或前伸，并且分析時間長。可根據固定液的使用溫度極限和樣品組分沸點調節柱溫。　　對于高沸點混合物，在保證分離**的前提下，盡量降低柱溫。可在低于分析物沸點180℃～200℃的柱溫下進行分析；對沸點不太高(200～300℃)的樣品，柱溫可選100℃以下；對于氣體、氣態烴等低沸點混合物，一般選擇室溫或50℃以下進行分析。對于寬沸程樣品，需采用程序升溫法進行分離，即柱溫按預先設定的程序隨時間成線性或非線性增加，從而獲得分離效果。　　載氣的選擇　　一般說來，痕量分析或毛細管色譜的載氣純化程度，要高于常規分析。特別是電子捕獲、熱導池檢測器，載氣純度直接影響靈敏度和穩定性，**要嚴格凈化。　　根據分析對象，對于色譜柱的類型，操作儀器的檔次和具體檢測器，若使用不合要求的低純度氣體，不良影響有以下幾種可能：　　a.樣品失真或消失：如H2O氣使氯硅樣品水解；　　b.色譜柱失效：H2O，CO2使分子篩柱失去活性，H2O氣使聚脂類固定液分解，O2使PEG固定液斷鏈；　　c.有時某些氣體雜質和固定液相互作用而產生假峰；　　d.對柱保留特性的影響：如H2O對聚乙二醇等親水性固定液的保留指數會有所增加，載氣中氧含量過高時，無論是極性或是非極性固定液柱的保留特性，都會產生變化，使用時間越長影響越大；　　e.檢測器：TCD：信噪比減小，無法調零，線性變窄，文獻中的校正因子不能使用，氧含量過大，使元件在高溫時加速老化，減少壽命；FID：特別是在Dt≤1×10-11/S下操作時，CH4等有機雜質會使基流激增，噪聲加大不能進行微量分析；　　f.在做程序升溫操作時，載氣中的某些雜質，在低溫時保留在色譜柱中，當柱溫升高時不但引起基線漂移，還可能在譜圖上出現比較寬的“假峰”；　　g.儀器影響：各類過濾器加速失效；調節閥(穩壓閥，穩流閥，針形閥) 被污染，氣阻堵塞，調節精度降低或失靈；氣路系統被污染，若要恢復儀器在高靈敏度情況下操作，有時要吹洗很長時間(可能一周以上), 污染嚴重時有時再也無法恢復；對于FID，水蒸氣會影響分析結果，直至影響檢測器的壽命；對ECD和TCD的壽命明顯，這點應引起用戶特別注意。　　載氣的壓力和流速　　載氣壓力對柱效率有直接的影響。如提高柱內壓力，有助于提高柱效率。但只提高入口壓力，使流速加大且壓降太大時，反而會降低柱效率，因此也必須提高出口壓力。一般采用在柱后加裝適當氣阻的方法來解決這一問題。　　載氣流速主要影響分離效率和分析時間。為獲得高柱效，應選用佳流速，但所需分析時間較長。為縮短分析時間，一般選擇載氣速度要高于佳流速，此時柱效雖稍有下降，卻節省了很多分析的時間。常用的載氣速度流速為20～80mL/min。　　對于FID 或FPD 檢測器，氫氣和空氣的比例是影響分離度和靈敏度的重要因素，只有反復試驗，才能確定適合的比例。對于填充柱色譜柱，載氣流入方向要盡量與色譜柱內固定相裝填方向一致，以減小壓差，提率。　　進樣量的選擇　　進樣量的多少直接影響譜帶的初始寬度。因此，只要檢測器的靈敏度足夠高，進樣量越少，越有利于得到良好的分離。一般情況下，柱越長，管徑越粗，組分的容量因子越大，則允許的進樣量越多。一般氣體進樣量在1～10mL，液體進樣量在0.5～10μL 之間，可取得較好的分析效果。此外，進樣速度要快，進樣時間要短，以減少縱向擴散，有利于提高柱效。　　氣化溫度的選擇　　氣化溫度取決于樣品的揮發性、沸點范圍及進樣量等因素。氣化溫度選擇不當，會使柱效下降。通常氣化室的溫度選擇為樣品沸點或高于沸點，以保證樣品能瞬間氣化；但不要超過沸點50℃以上，以防止樣品分解。　　對于一般的氣相色譜分析，氣化溫度比柱溫高10～50℃即可。但對于某些高沸點組分或熱穩定性差的組分，在其沸點左右分析會產生分解現象。此時應采取的措施是減少進樣量，采用高靈敏度檢測器，氣化室溫度的選擇應低于其沸點100～200℃。　　從以上介紹的選擇原則可以看出，各種條件往往同時影響色譜柱的選擇性和效率，它們之間既密切聯系又互相制約。因此在實際分析中，要作綜合考慮，靈活地運用這些原則，既要保證良好的選擇性，又要保證分離效率，合理地選擇佳色譜分析條件。

當色譜柱使用一段時間以后，柱內由于各種原因，滯留了一些高沸點組分或氧化物等，除柱效有所下降外，還可能出現基線波動或“鬼峰”。為了去除污染物，使柱效和基線恢復到原來的狀態，稱為色譜柱的再生。色譜柱的再生和柱老化有**區別和不同，它是柱在使用一段時間柱性能下降，經處理后盡量恢復到原來性能的過程。A、色譜柱在以下幾種情況必須再生處理a.使一段時間，柱效明顯下降；b.柱被污染，特別是在程序升溫時，基線漂移和噪聲超過容忍程度或出現“鬼峰”；c.柱頭塌陷，柱床短路或斷位(在玻璃柱中容易發現)，而出現尖峰或雙重峰；d.峰形展寬，保留時間明顯變化；e.待分離組分和固定相表面非特異性相互作用，引起保留時間較短的峰拖尾或出現雙峰；B、毛細管柱再生的幾種方法a.用載氣將色譜柱污染物沖洗出來；b.將柱頭截去100mm 或更長一些；c.若使用交聯的色譜柱，可在儀器上反復注射溶劑進行沖洗。常用的溶劑依次為丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可進樣5～10μL；d.交聯柱在儀器上沖洗無效時，可把柱拆下來用二氯甲烷或氯仿沖洗，溶劑用量視柱的污染程度而定，一般20mL 左右。C、色譜柱再生前應注意的問題當分析出現問題時，不能只考慮是柱問題，而馬上進行再生。除上述情況外，還應考慮樣品處理、進樣技術、操作有無失誤、數據處理參數有無改變等可能帶來的問題。a.襯管、預柱和檢測器被污染也會引起基線不穩定、出現“鬼峰”或裂解峰；b.新的注射墊也會引起基線漂移和出現“鬼峰”；c.襯管密封欠佳、柱安裝死體積或檢測器固有特性也會引起較早出現峰的拖尾；d.分析系統發生變化(如漏氣嚴重)也可能使保留時間突變；e.峰變寬，除柱效下降外也可能由柱外效應引起；f.進樣量太大也會引起峰變寬、拖尾或保留時間變短；g.色譜柱長時間樣品過載，保留時間也會變小等。D、色譜柱再生時應注意的幾個問題1.如前所述和色譜柱老化一樣，不是溫度越高越好，時間越長越好；建議不要使用長時間烘烤的方法，來處理受到污染的色譜柱，因為烘烤時，溫度會把污染的殘留物變成不能溶解的物質，再用溶劑清洗也無濟于事；2.儀器在高靈敏度操作時，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升溫過程中，溫度升到大于180℃后，基線明顯漂移是不可避免的；3.不同類型柱子，再生方法不同；4.樣品種類、組分、進樣量不同或操作時間長短不同，再生方法也不同；5.儀器本身條件如：氣源種類、純度、凈化條件、進樣口結構和操作檢測器不同，再生柱方法也有區別；6.高分子量組分污染色譜柱后，高溫再生時間長會導致固定相的老化；使用交聯或鍵合柱***好用溶劑漂洗再生，漂洗溶劑流動方向**要從柱出口注入。應該注意，毛細管柱交聯鍵合率通常不到90%，因此會漂洗掉未化學結合的液相部分，所以保留時間和分離狀態會有所變化；7.對于難揮發物，碳化物是不能通過再生除去，對于填充柱***好使用帶襯管氣化室進樣器，對于毛細管可通過把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有條件的可以使用預柱，把不揮發的有機物、無機物和顆粒材料阻留在預柱中，需要時更換預柱；8.在某些情況下，色譜柱要在溫度極限附近使用，這時基線漂移和大噪聲已不可避免，柱的再生要求只能視情況而定；9.不是所有色譜柱通過再生均能恢復原來性能。